尊龙凯时肠类器官培养攻略（阶段三）

IPS诱导肠类器官的培养过程主要分为三个阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将重点讨论第三阶段——类器官培养（14-28天）。

一、准备工作

实验所需的试剂和耗材包括人正常肠类器官培养试剂盒、低因子、无酚红的基质胶、15ml离心管、EP管、24孔细胞培养板以及金属冰盒等。以下是必要的组分和规格：

• 类器官培养基 A: 100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B: 250ml
• 原代组织消化液 C: 30ml
• 类器官传代消化液 D: 30ml
• 组织保存液 E: 100ml
• 类器官冻存液 F: 20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G: 250ml

二、操作流程

1. 加胶-点板-加液

该步骤是整个原代操作的关键。操作如下：

1. 准备工作：将基质胶放入金属冰盒中，置于4℃冰箱中融化过夜。枪头和离心管需在-20℃预冷至少半小时。融化后的基质胶需在4℃储存，建议2周内使用完。
2. 接种要求：在24孔板中，每孔加入25μl的基质胶球状体混合物和500-750μL的类器官培养基。
3. 接种密度建议：基质胶与球状体的体积比为25:1，若难以判断球状体的沉淀体积，可以使用300μl基质胶。对于需要计数接种的情况，建议保持500个球状体/25μl基质胶。
4. 加胶：将基质胶加入细胞团沉淀中，轻柔吹打混匀，然后进行点板。整个操作应在金属冰盒或冰上进行，以保持基质胶的流动性。
5. 加液：将铺好的培养板放入37℃培养箱中，等待40-60分钟成胶，然后添加500-750μl的类器官培养基A进行培养，通常在10-14天内，类器官直径达200μm-500μm后可进行传代操作。

2. 传代操作

对于类器官数量较多或体积较大的情况，传代步骤如下：

1. 类器官收集与洗涤：吸去培养基，向每孔添加4℃的类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集于15ml离心管中。
2. 洗涤：将类器官传代培养缓冲液G加至14ml，静置40min（或-20℃放置5min）使基质胶软化，然后进行离心。
3. 类器官消化：可添加类器官传代消化液，轻轻吹打，使细胞团保持，避免转化为单细胞。
4. 重复上面操作，如有基质胶残留，按上面的洗涤步骤处理。

三、冻存与复苏

冻存和复苏类器官时需注意：

1. 选择在类器官指数增长期进行冻存，通常在传代后的第3-4天进行操作。
2. 收集类器官，用缓冲液洗涤，然后进行离心，使细胞与基质胶分离。
3. 使用F冻存液重悬类器官，进行梯度冻存。

复苏时，将冻存管迅速放入37℃水浴锅中解冻，然后加入类器官传代培养缓冲液G重悬，轻柔混匀后进行点板培养。通常，再次传代的类器官在10-14天内可达到200μm-500μm的直径。

关键注意事项

进行极为小心的无菌操作，确保减少污染风险。同时，遵循上述步骤并不断进行优化，可以有效生成功能性的人类肠道类器官，适用于疾病建模和药物筛选等研究领域。我们提倡在实验中使用尊龙凯时的优质试剂，确保实验结果的可靠性。

常见问题与解决

如果实验中遇到问题，欢迎与我们进行讨论交流。通过不断优化操作细节，您也能获得令人满意的实验结果。