酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种在免疫学中广泛使用的实验方法，继免疫荧光和放射免疫技术之后而发展而来。ELISA主要用于检测样本中抗原或抗体的浓度，是一种高效的免疫检测手段。
在ELISA过程中，显色反应是最后一步，酶的催化使得无色底物转变为有色产物。反应的温度和时间是影响显色效果的关键因素。在设定的时间内，阴性对照孔将保持无色，而阳性对照孔会随时间延长而加深显色。此外，适当提高反应温度可加速显色过程。在定量分析中，添加底物后的反应条件必须精确控制；而对于定性分析，室温下的反应时间一般可以灵活调整，以便及时判断结果。
对于OPD底物，显色通常在室温或37℃下进行20-30分钟后就会停止，若继续延长反应时间，底值可能会增加。注意，OPD液体在光照下会自行变色，因此显色过程中应避免光照。反应结束时需加入终止液以停止显色反应，而使用硫酸终止后，显色会由橙黄色转变为棕黄色。
TMB底物对光照的影响较小，可以在室温下进行反应并观察结果。但为确保实验结果的稳定性，建议在规定时间内读取结果。TMB在HRP的作用下，约40分钟后显色达到峰值，随后会逐渐减弱，至2小时内变为无色。多种终止液可用于TMB反应，例如叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS），这些终止剂能够使蓝色持续12-24小时，从而便于目视判断。此外，一些酸性终止液将导致蓝色转变为黄色，此时需使用特定波长（450nm）测定吸光值。
在ELISA实验中，受检标本中的抗原与固相载体表面的抗体反应。对样本进行洗涤后，添加酶标记的抗体以确保充分结合，随后引入酶催化底物使其转变为有色产物，显色的深浅与样本中目标物质的浓度直接相关，从而实现定性或定量分析。
ELISA实验过程中，可能会遇到以下几个显色问题：
这一情况可能是由于标准品溶解时未充分震荡或未充分稀释所导致。在标准品溶解和稀释时需要采用涡旋震荡，以保证溶液均匀。
如果在孵育阶段静置于桌面上，会影响抗原与抗体的接触，导致显色效果不佳。建议使用ELISA专用的微孔板振荡器，以增强抗原抗体的结合效果。
这种情况通常并非试剂盒的问题，而是样本中目标蛋白浓度过低或存在干扰物质。目前，ELISA被广泛认为是蛋白检测灵敏度最高的方法，结合其他技术可以进行高敏ELISA等多种形式的检测。
此问题多与移液器的使用和实验者的操作习惯有关。操作人员应确保移液器的正确使用与维护，通过实践以提升移液的精密度。
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